Les enzymes de restriction sont des enzymes qui coupent l'ADN simple et double brin. Chaque enzyme de restriction a une séquence nucléotidique spécifique, appelée site de restriction, qu'elle reconnaît et coupe. Les enzymes de restriction sont utilisées pour le séquençage de l'ADN, l'analyse mutationnelle et le clonage et l'amplification de l'ADN. Les scientifiques utilisent des enzymes de restriction pour insérer des gènes d'intérêt dans des vecteurs d'expression, des molécules d'ADN qui peuvent se répliquer séparément de l'ADN chromosomique. Le vecteur contenant le gène d'intérêt peut ensuite être introduit dans une souche bactérienne pour l'expression et la caractérisation des protéines.
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Étape 1
Identifiez les sites d'enzymes de restriction sur votre vecteur en consultant une carte de restriction. La carte de restriction vous dira quelles enzymes vont couper votre vecteur et où.
Étape 2
Choisissez une enzyme de restriction qui a également un site présent sur votre REPLACEion de gène, en regardant la séquence de l'REPLACE. Assurez-vous que le site de restriction se trouve à un endroit de votre REPLACE qui est en dehors du gène d'intérêt, de sorte que vous ne perdiez aucune partie du gène.
Étape 3
Assurez-vous qu'il n'y a aucun doublon du site de restriction n'importe où dans votre REPLACEion de gène ou vecteur. Cela causera de multiples coupures dans votre ADN et vous donnera des données trompeuses.
Étape 4
Essayez de choisir des enzymes de restriction qui coupent avec des extrémités collantes, plutôt que des extrémités émoussées. Les extrémités collantes se produisent lorsque l'enzyme coupe l'ADN double brin d'une manière échelonnée, laissant un surplomb simple brin qui facilite la fixation avec une coupe d'REPLACE de la manière opposée. Les extrémités émoussées se produisent lorsque l'ADN double brin est coupé de manière lisse, et ceux-ci sont plus difficiles à attacher.
Étape 5
Choisissez une enzyme de restriction différente pour les deux extrémités de votre REPLACE pour vous assurer qu'il est inséré dans le vecteur dans la bonne orientation et pour vous assurer que le vecteur ne se fixe pas à lui-même.
Étape 6
Essayez de choisir deux enzymes de restriction qui fonctionnent bien dans le même système tampon et la même température. Si cela n'est pas possible, exécutez chaque digestion séparément.
Choses dont vous aurez besoin
- Séquence d'REPLACEion de gène
- Carte de restriction du vecteur de choix
- Liste des enzymes de restriction et de leurs sites coupés
Conseils
- Certains programmes Web ont été développés sites de restriction sur une séquence d'ADN rapidement. Un de ces programmes vient de New England BioLabs.
